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基本信息
论文题目：Modulationofintestinalmicrobiotabyglycyrrhizicacidpreventshigh-fatdiet-enhancedpre-metastaticnicheformationandmetastasis
发表期刊：MucosalImmunology
影响因子：7.
作者单位：武汉大学
本文中所涉及的微生物多样性测序由欧易生物提供服务
研究背景
肥胖是乳腺癌、晚期恶性黑色素瘤和结直肠癌的危险因素。这种现象在长时间高脂肪饮食（HFD）的小鼠中也有表现。HFD已被报道可促进肺转移前微环境的形成，但其具体作用尚未研究透彻。HFD可引起肠道菌群的变化促进肠癌的发生。此外，脂多糖（LPS）诱导的炎症可增加黑色素瘤的肺转移、代谢产物脱氧胆酸（DCA）则促进肝细胞癌的生长，故而从肠道菌群中下调LPS和DCA可能是HFD增强转移的潜在治疗策略。肺转移前微环境中巨噬细胞的募集有助于HFD对乳腺癌转移的促进作用，其中的M1型巨噬细胞增强结肠、肝细胞和卵巢癌细胞的转移潜能。而LPS诱导HMGB1的释放，后者通过NF-κB信号促进M1型表型。但通过重塑肠道菌群来调节巨噬细胞是否能阻止转移前微环境的形成和转移目前尚不清楚。甘草酸（GA）作为一种三萜皂苷，已被发现可以抑制肿瘤生长、黑色素瘤转移，改善HFD诱导的小鼠模型的肥胖和非酒精脂肪肝，并可抑制HMGB1活性。但其是否可以阻止HFD介导的肠道失调和转移前微环境的形成尚未报道。
研究内容
研究证明GA可以通过肠道微生物群降低HFD增强的转移前微环境的形成和转移。GA降低了4T1乳腺癌和B16F10黑色素瘤中HFD增强的骨髓源性抑制细胞募集、转移前蛋白SA8/A9表达和转移负担，并伴有肠道菌群改变和结肠巨噬细胞远离M1样表型的极化。机制层面上,GA处理通过减少M1样巨噬细胞的比例以及由LPS/HMGB1/NF-κB信号失活引发的CCL2、TNF-α的表达下调，抑制了Gr-1+骨髓细胞迁移和SA8/A9表达，进而中和了HFD促进的肠道微生物群失调的作用。综上所述，GA靶向肠道菌群调控结肠巨噬细胞可能是一种预防被HFD促进的转移前微环境形成和转移的新策略。
研究路线
研究结果
1．GA抑制HFD增强的肺转移前微环境形成，从而防止转移。为研究GA对HFD介导的转移的影响，通过检测荧光强度以及转移结节发现相较于HFD小鼠（所有小鼠均提前植入肿瘤细胞），HFD+GA小鼠的肺转移显著好转。HFD+GA小鼠相较于HFD小鼠，肺中促转移蛋白MMP-9和SA8/A9的表达以及浸润的MDSCs比例都有所下降，转移前肺中CD8+T细胞占比则上升。
图1｜GA抑制HFD增强的肺转移前微环境形成，从而防止转移
a.GA对HFD造成的肺转移增强的影响；c.GA对促转移蛋白在肺中表达水平的影响；d.GA对MDSC浸润的影响；g.GA对CD8+T细胞比例的影响
2．GA通过调节肠道微生物抑制HFD诱导的转移前微环境形成和转移。通过微生物多样性测序，对比对照组、HFD组小鼠、HFD+GA组小鼠的粪便微生物结构。LEfSe分析显示梭菌目和脱硫弧菌属主要作用于HFD介导的肠道菌群失调，GA则可显著抵消这种作用。体内实验显示当定植Des（脱硫弧菌）和Clo（索氏梭菌）后，LPS、DCA的水平显著上升，同时伴随MDSCs的浸润和转移结节数目的增加。
图2｜GA通过调节肠道微生物抑制HFD诱导的转移前微环境形成和转移
a.微生物多样性测序PCA图；b.门丰度统计结果；h.定植Des和Clo对LPS浓度影响；k.定植Des和Clo对肺MDSCs浸润的影响；i.定植Des和Clo对肺中转移结节数量影响；
3．GA调控HFD介导的结肠巨噬细胞表型改变。检测M1和M2型巨噬细胞的标记物，发现HFD及GA都对M1型巨噬细胞标记物的表达有显著的影响，HFD组小鼠M1型巨噬细胞标记物表达显著升高，HFD+GA组小鼠则无明显变化。相应的细胞数量、表达的细胞因子也呈现相同的趋势。LPS诱导HMGB1的释放促进M1型细胞的形成，而在外周血中可检测到HFD组小鼠的HMGB1显著升高。
图3｜GA调控HFD介导的结肠巨噬细胞表型改变
a.M1型巨噬细胞标志物在不同组中的表达情况；b.M2型巨噬细胞标志物在不同组中的表达情况；h.不同组别小鼠外周血中HMGB1的表达情况
4．GA调节的肠道微生物群可改变巨噬细胞表型及其细胞因子的产生。将Des和Clo定植到HFD+GA组小鼠中发现粪便和外周血中LPS和DCA升高。定植同时促进了HMGB1从细胞核向细胞质的转移、M1型巨噬细胞标志物的表达,提升M1型巨噬细胞占比。HFD组小鼠粪便提取物也可以提升M1型巨噬细胞的占比。
图4｜GA调节的肠道微生物群可改变巨噬细胞表型及其细胞因子的产生
b.Des和Clo定植后LPS和DCA的浓度变化，c（右上方）.Des和Clo定植后促进HMGB1从核到质的转运；e.Des和Clo定植后M1型巨噬细胞标志物表达上升；c（下方）.HFD组小鼠粪便提取物改变M1型巨噬细胞比例
5．GA调控结肠巨噬细胞表型可预估HFD增强的转移前微环境的形成和转移。利用抗CSF-1抗体耗竭巨噬细胞后比较其在HFD组小鼠和HFD+GA组小鼠中的作用。结果显示结肠巨噬细胞耗竭显著降低了HFD组小鼠肺转移前微环境的形成和转移结节的数量，但对GA没有明显的影响。说明GA主要通过使结肠巨噬细胞偏离M1表型来调控转移前微环境的形成和转移。
图5｜GA调控结肠巨噬细胞表型可防止HFD增强的转移前微环境的形成和转移
b.耗竭结肠巨噬细胞的影响；f.耗竭结肠巨噬细胞对转移前微环境形成相关蛋白表达水平的影响；f.耗竭结肠巨噬细胞对肺转移结节数量的影响
6．由GA调控的结肠巨噬细胞源性因子抑制转移前微环境的形成。HFD组小鼠结肠巨噬细胞条件培养基(CM)显著促进了Gr-1+髓细胞的迁移。而GA处理小鼠结肠巨噬细胞的CM显著抑制了Gr-1+髓细胞的迁移。HFD-CM组GzmB,IFN-γ和IL-2表达下调，但SA8和SA9表达上调，GA-CM组则有相反趋势的变化。Rescue实验显示TNF-α而非CCL2可部分逆转GA-CM对SA8和SA9表达的影响。
图6｜由GA调控的结肠巨噬细胞源性因子抑制转移前微环境的形成
a.HFD-CM、GA-CM对Gr-1+迁移的影响；e.HFD-CM、GA-CM对SA8和SA9表达的影响；g.Rescue实验结果
7．LPS/HMGB1/NF-κB信号是GA预防转移前微环境形成的关键。检测发现HFD+GA组小鼠p-p65的表达水平高于HFD组小鼠。免疫荧光结果显示HFD粪便提取物增加了p65的和核异位，但这种作用可被GA缓解。HMGB1的定位也会受到HFD的影响。外源LPS加入后，结肠HFD-fed小鼠体内的巨噬细胞p-p65的表达发生上调，IκBα的表达则下调。而这种影响会在转染HMGB1siRNA后被缓解。
图7｜LPS/HMGB1/NF-κB信号是GA预防转移前微环境形成的关键
a.IκBα和p-p65在不同组小鼠结肠巨噬细胞中的表达情况；d.P65在不同组小鼠中的定位；e.HMGB1在不同组小鼠中的表达情况；g.敲降HMGB1对NF-κB信号通路的影响
图8｜GA通过改变肠道菌群影响转移的模型
研究结论
本研究证明GA可以通过肠道微生物群降低HFD促进的转移前微环境的形成和转移，并发现其中的作用机制，即GA通过LPS/HMGB1/NF-κB信号减少M1型巨噬细胞缓解由HFD促进的转移，从而提供了一种新的潜在的阻止转移的治疗策略。
参考文献
QiuM,HuangK,LiuY,etal.Modulationofintestinalmicrobiotabyglycyrrhizicacidpreventshigh-fatdiet-enhancedpre-metastaticnicheformationandmetastasis.MucosalImmunol;doi:10./s---6.
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SoniaY撰文
本文系欧易生物原创
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