以下为文字版：
抛砖引玉的病例青年女性，发热，糖尿病酮症酸中*，Ⅰ型呼吸衰竭，低血压休克；双肺多发沿支气管血管束分布的结节及团片影，右肾被膜下混杂密度影。
入院后除纠正糖尿病酮症、抗休克、使用有创机械通气外，经验性的使用了亚胺培南1gq6h、万古霉素1gq12h和莫西沙星0.4gqd的抗感染治疗。本院所查外周血和BALF的细菌培养结果均为阴性；而同时送院外的NGS结果回报却均为肺炎克雷伯菌。
治疗约1周后为患者做了CT引导下的肾周穿刺引流，此次我院微生物室及院外NGS回报均为「播散性高*力肺炎克雷伯菌（hvKP）」。患者按血行播散型肺炎克雷伯菌感染治疗后安然出院。
在这3个阳性结果中，有两个是在关键时刻由NGS提供的。就此，我们看到了在常规微生物学检查阴性时，NGS检查所起到的举足轻重的作用。
国内外文献分享mNGS首次应用于临床的报道是出现在年新英格兰杂志上的一例个案：通过NGS诊断脑钩端螺旋体感染；国内速度也不慢，年，上海、天津和北京的相关机构就联合对7例发热待查的患者进行NGS检测；年，通过NGS诊断的第一例败血症休克的患者见著报道。年发表于新英格兰杂志的前瞻性研究表明，NGS可以提高中枢神经系统感染的微生物学诊断成功率。
国内方面彭劲民和杜斌教授回顾性分析了在免疫力低下的人群中，NGS对于诊断肺炎的作用，结论主要有两点：第一，对于少见微生物，NGS效果好；第二，NGS联合传统的微生物学检测方法，效率更高。
我们应该在多大程度上相信NGS？「与其相信NGS（或者其他的各种化验），不如相信我们自己！」这是我们大夫，尤其是内科大夫的立命之本。
在临床上，我们给患者做化验、使用药物，都是围绕我们的诊断、治疗目的而去的。当化验结果、病情变化出现时，首先要做的就是看这些结果和变化与我们的既定目标是否吻合、哪里吻合？哪里不吻合？为什么不吻合?这都需要通过医生的临床思考去得出结论。
我们一定要记住，NGS（或其他的各项化验）是为我们（临床）服务的，而不是我们（临床）为它们服务；再加上各种化验出现偏差的情况屡见不鲜；所以，一定要用自己的临床思维去考虑你碰到的一切问题，不管结果是阳性还是阴性。
NGS是什么？mNGS（metagenomicNextGenerationSequencing）是通过对临床样本的DNA或RNA进行鸟枪（shotgun）法测序，可以无偏倚、无偏差地检测多种病原微生物（病*/细菌/真菌/寄生虫）的一项技术。
NGS：也称高通量测序（High-throughsequencing，HTS），是一种可同时对数十万到数百万条DNA分子序列进行读取的测序技术。mNGS：m指宏（元）基因组，是标本中全部生物（人、微生物）基因组的总称。mNGS指对标本中的全部生物基因组进行NGS分析。临床宏基因组学：指用于临床诊断目的的宏基因组学，包括了治疗、感控、流行病学等。如何解读宏基因组高通量测序技术（mNGS）报告？作为临床医生，有两个名词是需要掌握的。
相对丰度：指除去宿主序列之后，该病原体在相应分类（细菌、真菌、病*和寄生虫四类）中的基因组的相对比例。丰度越高，该物种所占比例越高。它只能指示同一样本中某个物种的相对的量。如上图中，「克雷伯菌属」相对丰度90.5%，也就是克雷伯菌属在整个细菌属中占90.5%。序列数：通过高通量测序和生物信息学分析，可以唯一比对到某微生物属或种的特异性序列数目。如上图中，意味着表现出特异性的、符合克雷伯菌属的基因片段被发现了次。按理论来讲，相对丰度越高，可信度越高；序列数越多，结果越准。mNGS的优势1.诊断时间大大缩短：最快的24小时内即可出结果
2.诊断的阳性率高：因为传统常规微生物检测比较容易受到微生物数量的影响，比如一用抗菌素后，细菌的数量至少下降一个数量级。而对于NGS来说，只要有病原体的基因存在，用不用抗菌素与我无关。
3.发现的微生物种类多：因为目前有许多微生物尚无法通过传统常规手段去快速培养取得，常见如：支原体、衣原体、*团菌等。
4.在病*诊断方面，NGS无需提前筛选病原体的范围，甚至能发现新的病原体。现今常规病*病原体以免疫学检测为主，辅助PCR等手段，但它们均是对已知病*的验证性检测，无法检测出未知的病*。而NGS从基因层面可以发现更多、更新的病*，例如新冠病*，临床发现有问题，送NGS发现它与SARS高度相似，从而确定为新型冠状病*。
5.有望弥补对寄生虫感染检查的不足：常规寄生虫病确诊主要依据各种体液的镜检或免疫学检查，这对样本的收集要求、试验者的经验要求都很高，而基因组学则无需如此。
但是，我们必须要知道的是：目前公认的细菌性病原体诊断的「金标准」仍是传统培养法。
mNGS的不足1.mNGS无法确定它所检测到的序列是来自活菌还是死菌；所以，它依旧不能解决一直困扰我们的：如何鉴别定植菌和致病菌的问题。所以，检测出DNA只能表明存在何种生物，不能表明其是否存在生物学活性；也许检测出RNA会对此有帮助—RNA的存在可以提示这种生物具有转录活性。
2.mNGS仅限于粗略判断病原微生物的种类和估算微生物的大致比例（以序列读取总数的百分比来量化病原体读取量）。如果这个病原微生物在所在菌属中所占比例特别少，是极有可能产生阴性结果的。所以，阴性mNGS结果可能仅仅反映了样本的非微生物核酸成分（分母）高和/或微生物核酸成分（分子）低，而并不是病原体的缺乏。
3.一些低含量的胞内细菌，如：结核杆菌、*团菌、布鲁氏菌和细胞壁较厚的真菌的检出率会较低（后者需要特殊处理来破坏细胞壁、暴露DNA）。所以，对于所有类型的病原体，在相同的DNA提取技术下，其核酸回收率可能是不相等的。而这又产生了一个问题：检查不同目标微生物的标本，是否也需要有不同的提取方法？
4.相同的标本送到不同的试验/实验室，其结果可能会不同——因为现在尚无统一的操作程序及标准。临床上确实见到过这种不一致的现象。
5.mNGS的阅读核酸序列相对较短（bp），很难获取耐药基因全长序列等信息；也不能将耐药基因与相应的微生物物种进行关联。三代测序的长度可以达到bp，有可能覆盖耐药基因全长，对耐药基因的测定是好的帮助。
6.试验中选择对照标本的问题：
阳性对照应涵盖血液样本中可能遇到的微生物范围，如：包膜和非包膜病*，RNA和DNA基因组，革兰氏阳性、阴性菌，霉菌和寄生虫。但是，我们事前并不知道待测标本中含有何种病原体，那阳性对照应该选择谁？不选谁？
阴性对照也同样有问题，因为水和样品基质不能充分反映正常健康血液（其他）标本中存在的背景。
7.如何在从标本采集到处理、以及环境的步骤中避免核酸的污染，目前尚无标准化的协议。
8.如何解释测序实验室产生的结果：这是目前mNGS临床实践中最令人头痛的问题之一。一些机构已经实施了精准医疗团队——由微生物学、计算生物学、传染病学和其他临床医生组成，在报告前讨论结果并提供对结果的解释。这可能是目前的最佳选择。
9.在血液标本的mNGS测定中，现在尚无法区分致病菌与短暂的菌血症以及白细胞内所含微生物核酸片段的差别。在血标本的取样过程中，取血部位应如何消除正常菌群的干扰？取血部位应该是几个？取血量应该是多少？等尚无循证数据的支持。
总之，mNGS目前并不能取代当前的传统微生物检验方法，而是应该视其为这些传统方法的一种补充。
什么样的患者应该接受mNGS？我们以《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》（中华检验医学杂志February,Vol.44,No.2）为蓝本，看看mNGS应该如何应用于临床、了解mNGS所面临的挑战。
（一）临床适应证：
对常规微生物学检查容易明确病原体的感染，如尿路感染通过尿培养手段，不建议mNGS。患者表现为发热或发热症候群，病因未明确（符合不明原因发热定义），考虑感染或不除外感染，但规范性经验抗感染治疗无效，考虑应用常规技术检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。各种原因导致患者急危重症表现，不除外感染所致，或考虑继发或并发危及生命的严重感染，建议常规检测的同时，或在常规检测基础上，开展mNGS。免疫受损患者疑似继发感染，常规病原学检查未能明确致病原或/和规范性经验抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。疑似局部感染，病原学诊断未明确、不及时处理则后果严重（危及生命或会导致局部功能不可逆性丧失）时，考虑常规检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。如眼部（角膜炎/溃疡、眼内炎、急性视网膜坏死等）、鼻部、耳部、喉部感染、糖尿病足、外伤累及深部组织等情况。高度疑似感染性疾病，但病原学诊断未明确且常规抗感染治疗无效，建议进一步完善常规病原学检测、处理原发感染灶（如拔去导管、外科引流或拔去引流管、玻璃体切除）、调整经验抗微生物治疗方案的同时开展mNGS。慢性感染，或慢性疾病不除外感染，尤其是二者临床表现相似、难以鉴别时，病情严重或抗感染治疗疗效不佳需要明确病因，建议在完善常规检测、调整经验治疗的同时开展mNGS。除以上共识2～7之外的患者人群，不建议无条件普遍进行mNGS检测；进行mNGS检测前请感染病学和/或临床微生物学专家会诊。不建议应用mNGS技术评估抗感染治疗效果。总结：1.考虑感染性疾病，常规病原学检查阴性，规范性经验性抗感染治疗无效者。2.危重症、免疫力低下且不排除感染者（我们案例中的患者符合此点）。注意：这两类患者一定要在行常规病原学技术检测的同时，进行NGS检查。
（二）微生物学适应证针对微生物，考虑出现疑似新发病原体，或某特殊病原体，缺乏传统技术或传统技术手段不能确定种属时，建议常规检测的同时，或在其基础上，开展mNGS。临床表现高度怀疑感染性疾病而多种传统技术反复检测不能明确致病微生物，但仍高度怀疑微生物所致，建议继续完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。传统病原学检测的结果不能解释临床表现的全貌或/和抗感染治疗的反应，怀疑同时存在其他病原感染时，建议进一步完善更多检测技术的同时或在其基础上，开展mNGS。感染性疾病的病原体已明确或高度怀疑某病原体，临床表现提示该病原体可能具有特殊的*力表型，需要了解其*力因子的相关信息时，可以考虑对感染相应临床标本进行mNGS物种鉴定的同时，采用mNGS检测*力基因。总结：发现新的病原体时；常规手段不能确定感染性疾病的病原体，而需要进一步验证时；发现的病原体不足以解释临床表现时『需要了解病原体*力表型时。（三）耐药学适应证
感染发生在正常有微生物定植的部位，或检测标本采集有污染时（如支气管肺泡灌洗液），不建议采用mNGS进行耐药性检测。感染发生在正常无微生物定植的部位且标本采集过程污染概率低时，可以考虑采用mNGS进行物种鉴定的同时检测耐药基因，并通过耐药表型试验对耐药基因进行验证。对有菌种特异性的耐药性基因，在测序深度足够时，可以考虑应用mNGS检测获得性的耐药基因，预测耐药表型。总结：总体的意见是负相的！我们上面说过，mNGS的阅读核酸序列相对较短（bp），很难获取耐药基因全长序列等信息，也不能将耐药基因与相应的微生物物种进行关联。90%以上一致同意，则该共识描述为「建议」；70-90%同意，则该共识描述为「考虑」；70%以下则不纳入共识推荐。
（四）流行病学和感染控制学适应证——实验室的规范和要求有近十条共识是针对实验室的要求，代表性的为对mNGS整个检测和分析流程进行性能验证是其应用于临床的瓶颈，建议对感染性疾病常见的「代表性」物种进行检出限、包容性、抗干扰、精密度、携带和交叉污染、稳定性等的验证。总结：每条共识的背后都包含着艰巨而繁重的工作，这从共识28条中，就可以得到验证。（五）mNGS应用于感染性疾病的报告解读：
mNGS检测报告中，建议结合不同标本类型与检出病原微生物的种类进行解读，区分无菌部位（血、无菌体液、组织、骨髓等）与正常有菌部位（如呼吸道、尿液、开放性伤口）。确认致病微生物时，应考虑检出微生物是否为感染部位的潜在病原。如脑脊液检出新型隐球菌，呼吸道标本检出结核分枝杆菌、腺病*、流感病*，关节液或血液标本检出布鲁菌属，均可认为是致病微生物。注意排除常见定植菌、污染菌与工程菌的影响。
总结：首先要弄清楚，报告的病原体是来自有菌区域还是无菌区域？这两个部位的含义是不一样的。无菌区域的结果较有菌区域的结果可信，此时需要考虑更多的是定植/污染/工程菌的影响问题。而文中对有菌区域结果的描述也不是绝对的，若有与临床不符的情况，仍需认真考虑、慎重对待；此外，呼吸道标本中还要考虑病*（如鼻病*）的定植问题。对发现的常见病*，仍需进行（RT）PCR的复检。
血浆样本对cfDNA进行mNGS检测时，建议从临床的角度鉴别检出序列属于致病微生物、样本污染、死亡微生物裂解，还是定植菌群所致的一过性菌血症。
总结：游离脱氧核糖核酸（cell-freeDNA，cfDNA）：循环中的cfDNA分子来源于濒死的人类细胞和定植或侵入的微生物，在分解时将核酸释放到血液中。
由于mNGS无法确定它所检测到的序列是来自活菌还是死菌，所以上述的建议要求在临床角度很难实现。我们只能依靠自己的临床思维「去伪存真」、接近真相。
mNGS报告中常规容易培养的病原菌，建议临床医师结合传统方法，综合判断其临床价值。
总结：细菌性病原体的「金标准」依旧是传统培养法；传统与新技术同步，取长补短。
建议对于在核酸提取过程中破壁困难的微生物，如分枝杆菌属、诺卡菌属、真菌（主要包括曲霉菌、毛霉菌、隐球菌属与双相真菌）等，即使在检测报告中读长数较低，也要考虑其为致病微生物的可能，并采用其他方法验证，如特异引物的PCR或一代测序等分子生物学检测，G试验，GM试验，曲霉菌IgG抗体或隐球菌荚膜多糖抗原等血清学试验。
总结：读长：测序仪单个测序反应所得到的碱基序列。读长长度指该碱基序列的碱基数，读长数量指测序获得的碱基序列的数量。报告中列出某种署名下的读长数，即为该微生物种属特异性片段的数量。我们原本就不能根据序列的多寡来判断致病菌的是与否。当遇到临床怀疑上述微生物、而结果不支持时，就更应该需要考虑到细胞壁破坏是否彻底的问题。同时，不应忽略传统手段的临床价值。
mNGS结果为阴性，对于排除感染常具有较好的阴性预测值。但对于某些病原微生物，如结核分枝杆菌等，原始样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物，应考虑mNGS检测灵敏度较低，阴性预测性差，并不一定优于PCR等常规检测方案。
总结：对常见的、数量多的病原体，mNGS的灵敏度非常好，应该可以检测出来——故此可以作为阴性排除。大家千万不要小看阴性排除的作用，结果不能告诉我们是什么、但能告诉我们不是什么，其意义也是非同寻常的。但对于某些样本中含量较少，或核酸提取困难的病原微生物（如分枝杆菌等），因其检测灵敏度较低，阴性预测性就差。
采用mNGS进行病原微生物鉴定的同时，可以考虑检测耐药基因，但需要将耐药基因准确定位到具体的病原体上以明确其临床价值。即通过对mNGS测得序列进行具体病原体基因组组装之后，确定耐药基因位于哪个病原体上，位于质粒上还是位于染色体上。
总结：总体而言，耐药基因的运用因受技术的限制，价值有限。但当有些特定情况出现时，如（尤其是在无菌环境、单独）发现结核分枝杆菌、CMV、真菌等少见微生物时，耐药基因的价值就非同寻常了。
mNGS对于新发或少见病原微生物的检出具有重要价值。建议解读报告单前应了解比对数据库的内容，明确其是否涵盖少见病原或新发病原。检出高致病性病原微生物，应及时与临床联系。
总结：对于新发现的病原、新出现的高致病力病原以及少见病原，实验室要与临床密切联系，高度合作。
建立mNGS病原诊断的阈值影响因素较多，包括测序平台、测序流程、标本类型、病原种类、患者状况，目前尚无统一公认的阈值，建议各实验室建立自已的阈值，并在临床工作中加以验证。
不同病原微生物读长对结果判断的影响：同等条件下（相同微生物，相同标本），如某一微生物检出的读长数量多，为致病微生物的可能性大。但是，不同病原微生物基因组大小不同（寄生虫真菌细菌病*），核酸提取效率存在差异［难易程度：病*革兰阴性菌革兰阳性菌（不包括分枝杆菌、需氧放线菌等）真菌］，致病力也相去甚远，因此不能仅仅依靠读长多少来判断是否感染，建议同时考虑病原微生物种类差异与致病特性。
总结：这两条共识反应出专家们希望能为每种病原体建立一个诊断阈值的美好憧憬；但现实很骨感。这也从另一个侧面反应出了mNGS所面临的一系列挑战、以及临床综合分析在使用mNGS结果过程中的重要性—比如，难道某种微生物序列少，它就不是致病菌了？我们不该考虑该致病菌的*力吗？不该考虑患者的基础疾病吗？这都需要通过我们的临床思维给出答案—而这再次印证了我的开场白「与其相信NGS（或者其他的各种化验），不如相信我们自己！」
从以上的分析中，我们可以看到：mNGS作为一种新的检测手段，拓宽了微生物检查的途径和范围、弥补了常规检测手段的一些缺憾。它可以成为未来技术革命的基础；但是，目前它还并不是一种颠覆性的手段，而只是既往常规手段的补充和延伸。我们在常规检测中所面对的问题，在mNGS中依然要面对；这一点并没有变。比如：如何鉴别致病菌和定植菌？数量多就是致病菌？某某阴性就不是致病菌？等等。所以，我们要认识到：临床的综合思维依旧是现今临床感染性疾病诊治的核心，mNGS只是为这个核心提供了一种新的手段。
本文由言瑾整理自王京岚教授的专题报告《呼吸与危重症医生眼中的NGS》，感谢王京岚教授的审阅！
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