研究背景
肠道病*群包含许多对人类重要的病原体，包括脊髓灰质炎病*，柯萨奇病*，鼻病*以及新兴的EV-A71和EV-D68病*。本文中作者描述了感染柯萨奇病*B3的人细胞的蛋白质组和磷酸化蛋白质组的无偏倚，全系统范围和时间分辨的分析。病*是专一性的细胞内寄生虫，可重塑宿主细胞的结构，组成和代谢，以支持感染。病*感染可引起细胞抗病*和应激反应。肠病*的生命周期是高度保守的，人们认为不同的肠病*以相似的方式修饰宿主细胞。在过去的几十年中，质谱已发展成为一种强大的技术，现在可用于研究成千上万的蛋白质和磷酸化位点，结合准确的定量方法，可以评估蛋白质组和磷酸化蛋白质组动力学，并用于研究宿主与病原体的相互作用。本文着手发现肠病*感染过程中和/或参与肠病*感染后所调节的信号通路，这可能会发现抗病*治疗的新药理方法。研究内容
1.CVB3感染细胞的蛋白质组/磷酸化蛋白质组分析通过单次nLC-MS/MS分析和精确的相对定量分析了感染细胞在不同时间点的样本，直至感染后10h，复制周期完成并且细胞显示出CPE指示其死亡。从8hpi起，感染的细胞发生了实质性变化，而在10hpi发生了最广泛的变化。采用的Fe（III）-IMAC富集策略的高富集选择性促进了高磷酸化蛋白质组覆盖度，分析表明蛋白质磷酸化经历了最大程度的变化，中位变化约为七倍，表明磷酸化蛋白质组比蛋白质组对CVB3感染更具活力和敏感性。Fig1.蛋白质组/磷酸化蛋白质组学数据的实验设计和概述。a.实验设计：用于CVB3感染HeLa细胞（磷酸化）蛋白质组分析。b.总结已鉴定（identified,ID）和定量（quantified,Q）的肽，磷酸肽，蛋白质和磷酸化位点的。富集特异性，定义为每个样品中检测到的磷酸肽的比例。c.CVB3感染过程中蛋白质组和磷酸化蛋白质组整体变化的时间动态，表明磷酸化的变化比蛋白质水平的变化发生得更早。d.使用ANOVA测试评估，感染期间蛋白质和磷酸化的动态调节。e.受显著调节的蛋白质和磷酸位点变化幅度的分布，表明磷酸化的差异通常比蛋白质水平的差异更大。2.鉴定由CVB3感染激活的激酶作者进一步利用了广泛的磷酸化蛋白质组学数据集，并预测了潜在激酶。我们使用了两种独立的方法：（i）motif-x14，它仅基于位于受调节的磷酸位点两侧的氨基酸序列来识别富集的线性激酶基序，以及（ii）NetworKIN15，其预测负责调节位点磷酸化的上游激酶（图2c）。ATM/ATR的靶标在cluster1中高度富集，即在病*感染过程中逐渐增加，而在嗜碱性激酶中，主要预测PKC和几个GRKs为早期增加/晚期减少位点(cluster2)。Fig2.蛋白质组/磷酸化蛋白质组学数据的动态和功能分析。a.蛋白质随时间差异表达的Z值蛋白质丰度（LFQ强度）的热图（ANOVA，FDR0.05）。包含个下调的蛋白和个上调的蛋白。b.个CVB3调控的磷酸位点的z评分位点强度的热图和层次聚类（ANOVA，FDR0.05）。c.通过NetworKIN对CVB3调节的磷酸位点进行的上游激酶预测分析表明，在感染的进程中，几类激酶的激活方式不同。3.CVB3感染过程中mTORC1信号的失活mTORC1的信号传导途径在调节细胞代谢，生长，增殖和存活起重要作用。mTORC1的活性受生长因子，营养物质的利用和细胞能量状态等信号的调节。为了响应这些信号，mTORC1将其磷酸化，以控制一系列功能（包括翻译和自噬）。本文中的磷酸化蛋白质组覆盖了mTORC1网络中的许多磷酸化位点（图3）。网络分析显示mTORC1激酶活性总体下降（图3）。由于很难从mTORC1亚基自身的调控位点推断出mTORC1的活性，因此分析了几个mTORC1靶标。真核翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）的磷酸化蛋白质组学分析显示，几乎所有检测到的被mTORC1直接磷酸化的位点的磷酸化都降低了，通过使用几种磷酸特异性4EBP1抗体的蛋白质印迹法证实了这一点（图4）。从6hpi开始，mTORC1直接将4EBP1的几个残基磷酸化逐渐丧失，最终在8hpi时磷酸化几乎完全丧失。作者分析了核糖体蛋白S6激酶B1（RPS6KB1，也称为p70S6K），它是控制mTORC1下游信号向翻译调控的枢纽。没有检测到关键的调控残基S，该残基被mTORC1磷酸化并激活p70S6K，我们可以从核糖体蛋白S6（RPS6）、程序性细胞死亡蛋白4（PDCD4）和真核起始因子4B（eIF4B）上七个检测到的p70S6K靶位中的六个的降低的磷酸化中推断出p70S6K活性的明显抑制，从而共同导致翻译和细胞生长减少。通过用特异性识别在S/处磷酸化的RPS6的抗体进行的蛋白质印迹法证实了这一点。Fig3.感染CVB3的细胞中mTORC1信号转导中的磷酸化事件概述。Fig4.肠病*感染细胞中mTORC1活性的分析。a.感染细胞的Westernblot分析显示mTORC1抑制。b.HeLa细胞感染CVB3或脊髓灰质炎病*。c.仅当在不存在胍的情况下用CVB3感染细胞时，mTORC1抑制才能从4EBP1条带折叠成磷酸化程度最低的较低条带中体现出来。4.mTORC1失活依赖于CVB3的翻译和复制我们假设CVB3进入期间诱导的细胞信号转导事件足以诱导mTORC1抑制。肠病*进入涉及病*基因组在溶酶体限制膜上的递送，这需要以未知的方式穿刺该膜。为了测试在CVB3进入期间发生的溶酶体损伤是否足以诱导mTORC1的抑制作用，我们用CVB3感染了细胞，并与复制抑制剂胍孵育了8小时（图4）。在这种情况下，CVB3感染不会导致mTORC1活性的抑制。在肠病*感染期间对mTORC1活性的抑制取决于病*基因组复制和/或随之而来的高病*蛋白表达水平。5.mTORC1下游转录因子EB（TFEB）通过EV影响非裂解病*的释放作者使用TFEB敲除（TFEBKO）细胞研究了TFEB是否是肠道病*感染的关键因素。在这些细胞中，我们证实了TFEB激活与溶酶体/自噬体基因表达增加之间存在因果关系。FEBKO细胞中在8hpi时细胞外病*滴度降低了5到10倍，细胞外病*的差异不是由细胞完整性的差异引起的，因为感染后8hpi的细胞仍处于诱导细胞死亡的早期，并且感染的野生型和TFEBKO细胞的细胞裂解量相似（图5b）。除了诱导细胞裂解外，病*还可以非裂解的方式从受感染的宿主细胞中释放，最显著的是通过脂质双层包裹的EV内部病*的萌芽和释放。在没有TFEB的情况下，对裸露病*和含EV的密度级分中病*回收率的量化显示，EV封闭的病*释放显著降低（图5c）。由于TFEB是自噬机制的中心枢纽，因此可以通过Westernblot检测LC3的脂化作用来监测CVB3诱导野生型和TFEBKO细胞自噬的能力。尽管在模拟处理或感染的TFEBKO细胞中均未观察到细胞内自噬水平的缺陷（图5d），但TFEB敲除几乎完全阻止了感染细胞的EV分离物中LC3的分泌（图5e）。该结果证实了所观察到的EV包围的病*释放减少。TFEB似乎增强了分泌性自噬途径，该途径在感染过程中会开启，以介导非溶解性病*的释放。Fig.5：TFEB在感染的早期促进了CVB3的非裂解释放。a.在缺乏TFEB的细胞中，细胞外病*的积累被延迟。b.TFEB敲除不影响8hpi的细胞活力。c.TFEB敲除削弱了细胞外囊泡封闭的病*释放。d.e.TFEB敲除影响分泌自噬的诱导。d为全细胞裂解液。e为上清液。讨论
作者对肠道病*感染的人类宿主细胞进行的无偏蛋白质组和磷酸蛋白质组分析表明，感染引起的细胞蛋白质组变化发生在多个水平，最显著的变化发生在翻译后水平。对于大多数磷酸酯酶，功能知识的严重缺乏严重阻碍了功能效应的归因。尽管如此，网络分析和专门的实验仍使我们可以将mTORC1信号作为主要网络进行剖析，该信号在病*感染期间发生了变化，这可能是通过TFEB导致通过EV传播病*。本文中（磷酸）蛋白质组数据集为进一步分析肠道病*引起的细胞基础结构和代谢变化提供了丰富的资源。名词解释：CPE:cytopathiceffect,细胞病变效应，病*在宿主细胞中复制后导致细胞内发生一系列变化,如：开始时，细胞核发生变化，染色质着边，核浓缩，随后细胞膜发生变化，失去黏附作用，细胞变圆，从培养瓶壁脱落，或细胞互相融合等。■AUTUMN
本文作者：YangWan-qi
原文引用：GiansantiP,StratingJRPM,DefournyKAY,etal.Dynamicremodellingofthehumanhostcellproteomeandphosphoproteomeuponenterovirusinfection[J].Nature