大家好，不知不觉秋分已过，正所谓“暑退秋滑气转凉”，大家在忙碌的学习和工作中，也需要适当的休息，给自己来杯秋后的奶茶。
今天给大家分享的这篇文章是来自荷兰瓦赫宁根生物兽医研究所HenkJ.Wisselink教授团队关于评估三种血清学方法诊断牛支原体感染性能的相关研究工作。
背景
牛支原体(Mycoplasmabovis，M.bovis)是一种新兴的牛病原体，在世界范围内给养殖业造成了巨大的经济损失。感染可导致多种临床体征，例如关节炎，肺炎，乳腺炎和角膜结膜炎，然而这些症状都不是牛支原体所特有的。因此，实验室诊断对该病原的鉴定与防控策略的实施是至关重要的。
传统上，细菌培养鉴定一直被认为是牛支原体鉴定的金标准方法，但这及耗时又耗力。然而该方法的检测结果也可能受到牛支原体次优取样、运输程序以及取样前的抗菌处理的阻碍（如使用抗生素治疗疾病）等多种因素共同影响从而导致诊断结果出现误差。因此在过去的二十年里，基于PCR的牛支原体检测越来越受到检疫人员的青睐，它克服了培养诊断相关的困难。然而，PCR方法也高度依赖于采样时所分离到的病原，以及DNA提取的效率，以及需要具有灵敏检测的特异引物和探针。
随着对快速，廉价和方便的测试的需求，用于畜群水平测试的血清学检测已经开发并广泛使用了几十年。这些方法被设计用来回顾性检测牛的牛支原体抗体，当牛群暴露在病原中，产生了可被检测到的体液免疫反应抗体(通常是在感染后2-3周)。
现阶段常用的几种血清学诊断试验，每一种都有其优点和局限性。Westernblot分析(免疫印迹)被认为是一种可靠和特异的方法，适用于验证试验，但该方法费时费力，并不适合大批量样品的筛选。因此对于常规的实验室血清学诊断，使用酶联免疫吸附分析(ELISA)通常是首选的方法。ELISA分析中使用的抗原的选择是十分重要的，因为它必须（1）对所有目标细菌菌株都具有特异性并普遍存在，（2）在感染过程中持续表达，并且（3）能被宿主的体液反应所识别，与感染的临床结果无关。牛支原体的抗原变异是公认的，因此之前最初开发的检测方法大多都采用全菌抗原。近年来基于重组DNA技术在大肠杆菌中表达的抗原的ELISA试验不断的被开发利用，然而在缺乏商业标准化生产方法和对照的情况下，不管是全菌抗原还是重组抗原当将内部检测方法流程转移到其他实验室时，与抗原包被的重复性相关的可变性可能使比较成为问题。因此开发一种特异性和普遍易用性的牛支原体ELISA方法对于诊断牛支原体病是极为重要的。
现阶段在国际上用于检测牛的牛支原体抗体的两种商业化生产的ELISA试剂盒主要为BIOK（比利时Rochefort的Bio-X诊断公司）和Bovicheck（加拿大魁北克的BiovetInc.）。最近另一种采用重组抗原用于检测牛支原体的商业化ELISA技术也已问世，IDScreen?ELISA（法国戴维斯（IDvet），法国），然而此ELISA尚未经过诊断实验室的评估。
目的：
精准的检测手段有助于检疫人员快速和准确的诊断牛支原体病原，然而牛支原体自身存在着可变性。因此作者为了寻找一种较好的诊断方法，通过联合多家实验室共同分析评估三种在国际上较为流行的血清学方法对牛支原体感染的诊断性能。
方法：
因此来自六个欧洲国家的研究人员共同设计并参与了一项实验室间试验，目的是通过实验室间比较，评估两种商品化的牛支原体血清学诊断试剂盒(IDVET的IDSCREEN?ELISA和BIO-XDiagnostics的BIOKELISA)的敏感性(Se)和特异性(Sp)。同时使用WB作为第三种方法，使用潜在类别分析(LCA)（详见推文底部）进行统计评估。
结果与讨论
在WB分析的份血清样本中，77份(43%)显示出与牛支原体感染一致的带型，被归类为阳性，份(57%)为阴性，因为没有50和85kDa的指示免疫原带。这包括来自瑞典北部的所有90个血清样本。阳性血清样本均来自高流行地区(图1；表1)。
Fig1Westernblot(WB)检测不同血清与牛分枝杆菌菌株L的反应性
（+：阳性对照；-：阴性对照；红色箭头表示预期所有阳性血清中的主要两条带）
作者采用IDscreen?ELISA试剂盒检测样本结果表现为44％的血清样品的S/P％≥60％。在两次重复试验中，六个不同实验室的阳性测试结果比例在43%到46%之间(表2)。对于不同的群体，使用此测试，高流行区域的样本中有87％呈阳性，低流行区域的样本中有0.4％是呈血清阳性的（表3）。用BIOKELISA试剂盒检测，29%的样本S/P%37%，按照制造商推荐的标准分类为阳性。在两次重复试验中，六个不同实验室的阳性测试结果的比例在16%到66%之间(表2)。通过不同的群体，用BIOKELISA检测到高流行地区46%的样本和低流行地区12%的样本为血清阳性(表3)。通过对比我们发现IDscreen?ELISA与BIOKELISA两个不同品牌的试剂盒对相同样本的检测结果表现出一定的差异性。
随后作者通过统计学进一步分析两种酶联免疫吸附试验的精密度。对于BIOKELISA试剂盒而言，两次重复试验的结果一致性较差，6个实验室对56个血清样本两次检测结果均表现出不同。对于IDScreen?ELISA试剂盒而言，两次重复试验揭示了5个实验室仅对于6个血清样本的两次重复试验结果均表现出不同。这表明相比于BIOKELISA试剂盒而言，IDScreen?ELISA试剂盒具有更高的分辨率。
附件1：两种酶联免疫吸附试验的精密度比较
WB和两种ELISA试剂盒的准确性由贝叶斯LCA使用信息先验以及三种诊断试验的均匀分布和协方差估计。根据诊断图，所有的LCA模型都收敛了。使用信息先验的模型和使用均匀分布的模型之间的差异很小，但表4中列出了这两个模型以供比较。一般来说，除了Wb和IDScreen?ELISA之间的协方差(覆盖Se=5.4%；具有信息先验的模型)之外，Se和Sp的三种测试之间的协方差可以忽略不计(≤0.5%)。因此，表4中仅给出了假设WB和IDScreen?ELISA之间存在协方差的模型。WB、IDScreen?ELISA和BIOKELISA的SE估计分别为91.8%、93.5%和49.1%。基于信息先验的模型，SP分别为99.6%、98.6%和89.6%。关于不重叠的后验可信区间(PCI)，WB和IDScreen?ELISA的Se和Sp均显著高于BIOKELISA(表4)。
综上所述，在这项研究中六个实验室对两种市售ELISA试剂盒检测性能的差异结果，表明使用此类测试存在局限性，并突出了定期评估检测性能的重要性，即使使用商业测试也是如此。因此需要进行多种诊断方法结合使用进而对牛群中的牛支原体感染状况进行最佳监控。通过组合使用经过验证的诊断工具，经过良好评估的样本策略以及在畜群和动物水平上的临床症状信息，可以帮助我们改善对牛群中牛支原体的监测，同时加深我们对牛支原体感染的流行病学的了解。随着人们越来越认识到牛支原体在牛呼吸系统疾病和乳腺炎中的重要性，又由于该病原具有可变性，因此我们急需开发一种特异性且可重复的血清学检测方法，以提供高精度和准确度来诊断全球牛群中的牛支原体感染。
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