前言
呼吸道感染是导致5岁以下儿童死亡的重要原因。呼吸道感染病原的快速、准确鉴定对于制定有效的抗生素治疗方案具有重要意义。但是传统病原检测方法有检测周期长、检测范围窄、阳性率低的缺点。
宏基因组测序对样本中的所有微生物核酸进行测序，这种非靶向的策略可以检测所有潜在的病原，包括罕见病原或新发病原，故被广泛应用于临床各类感染性疾病的诊断中。宏基因组测序的平台包括Illumina(二代)和Nanopore(三代)测序。三代测序与二代测序相比具有建库时间短、测序系列长、实时数据分析的优势，对于病情危重，需要尽快明确病原、疑似新发病原或者特殊病原的诊断具有重要意义。本研究以1例重症肺炎患儿的肺泡灌洗液标本为例，比较三代测序、二代测序和传统检测方法在检测结果、时间和成本等方面的优、缺点。
方法
1、传统方法病原检测
培养和菌株鉴定使用VITEK2自动分析仪完成，PCＲ荧光定量检测试剂盒(达安基因)检测肺炎支原体、巨细胞病*、EB病*，直接免疫荧光法检测腺病*(美国DiagnosticHybrids)，按照说明书进行操作。
2、宏基因组测序
宏基因检测得到医院(我院)伦理委员会批准(编号:-)。利用患儿肺泡灌洗液样本传统检测后剩余标本(2mL)行宏基因组测序。
结果
病例报告
男，3岁6个月，因“发热10d，咳嗽3d”入院感染科。入院前予盐酸伐昔洛韦治疗3d，阿昔洛韦、头孢唑肟钠静滴治疗1d，疗效不佳。入院后根据EB病*检测阳性结果于第1～15d予阿昔洛韦；第2~5d予干扰素雾化；第2～9d予头孢曲松。第4～8d经验性予阿奇霉素、第9～11d予美罗培南。入院7d后仍有发热，咳嗽加重，X线胸片提示左侧肺炎，胸部CT提示肺炎肺实变，呼吸科会诊后行支气管镜检查术和肺泡灌洗术，收集肺泡灌洗液，行传统方法病原检测，发现肺炎支原体检测阳性，第11～19d调整为左氧氟沙星。治疗19d后，体温正常，咳嗽减少，X线胸片、炎症指标好转出院，门诊随访。
传统方法病原学检测结果
肺泡灌洗液2d普通培养阴性，腺病*抗原检测阳性，肺炎支原体PCＲ定量检测阳性。血浆PCＲ检测显示EB病*阳性。图1三代宏基因组测序检测腺病*注A:三代测序检测流程;B:三代测序产出序列数和检测时间的关系，红色方框表示测序开始后产出的第1个fastq文件的时间;C:腺病*序列长度分布;D:宿主序列长度分布三代测序结果
从收到样本起，DNA提取用时1.5h，三代测序文库构建用时1.5h(图1A)。三代测序平台允许实时分析测序数据，在测序开始12min后，输出的第1个fastq文件中即检出腺病*条序列(图1B)，从收到样本到检出腺病*共用时约3.2h。测序结束后，共得到条序列，检出条腺病*序列，占比2.02%(图2A)。图1C显示，腺病*序列平均长度(IQＲ：～)bp，图1D显示，宿主序列平均长度(IQＲ：～)bp。除腺病*外，还检出EB病*、肺炎支原体各1条序列(图2B)。图3A显示，三代测序序列比对到腺病*参考基因组(NC_.1)上后，覆盖度达%，96.69%的基因组被＞0bp序列覆盖，平均测序深度×(IQＲ：~)。图2三代和二代宏基因组测序检出结果比较注：括号中的数字代表序列数;A:三代测序;B:三代测序结果中除腺病*外，其余7种微生物序列数;C:二代测序;D:二代测序结果中除腺病*外，其余5种微生物序列数二代测序结果
测序文库构建用时4h，从上机到测序完成用时44h，数据拆分用时4h。在二代测序完成后进行数据分析，数据分析耗时约2h，从收到样本到检出腺病*序列共用时55.5h(包括DNA提取1.5h)。二代测序共得到条序列，其中检出腺病*序列共条，占比1.50%(图2C)。除腺病*外，还检出19条EB病*序列，2条肺炎支原体序列(图2D)。图3B显示，二代测序序列比对到腺病*参考基因组(NC_.1)上后，覆盖度达到96.62%，96.07%的基因组被＞bp序列覆盖，平均测序深度×(IQＲ：～)。图3腺病*基因组范围三代和二代测序覆盖度注：A:三代测序;B:二代测序3种方法间的比较
表1显示，三代和二代测序均一次性检出3种病原(腺病*、EB病*以及肺炎支原体)，还检出普雷沃菌等定植菌。三代测序检出腺病*周期最短，为3.2h。测序成本从高到低依次为三代测序、二代测序和传统检测方法，其中传统方法肺泡灌洗液培养为人民币元，呼吸道常规病原检测(呼吸道合胞病*、腺病*、偏肺病*、副流感病*、流感病*的抗原检测，以及支原体、衣原体、巨细胞病*PCＲ)为人民币元，EB病*检测(病*抗体和PCＲ)为人民币元。表1三代测序序列错误率
为了评估三代测序的错误率，以二代测序序列作为标准，组装腺病*参考序列。组装完成共得到14条contig，总长bp，最长的contig长度为bp。以最长的contig为参考序列，使用blast将三代测序序列比对到参考序列后，发现三代测序序列与参考序列的平均相似度为92.8%(IQＲ：91.1%～95.2%)，对应三代测序序列的平均错误率为7.3%(IQＲ：4.8%～8.9%)。结论
1、二代、三代测序较传统方法有更多的病原微生物发现。
2、三代(3.2h)较二代测序(55.5h)和传统检测方法(48h)用时更短，便于更早行合理的、有针对性的用药。三代检测费用高，但二代测序和传统检测方法在结果未报告前(45h)的经验性用药风险大，经验性用药同样产生费用。
3、三代测序对实验室空间、配套设备的要求较低，随着技术的不断发展以及成本的降低，其有望成为新的快速临床检测方法。
4、宏基因组三代测序能实现对所有潜在儿童呼吸道病原微生物的快速实时检测。
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