材料与方法
材料质粒和核酸DNA。根据NCBI中的鹦鹉热衣原体23SRNA基因序列，运用DNAstar软件进行同源性分析和BLAST序列分析，筛选出23SRNA基因高度保守序列，以筛选获得的高度保守序列作为检测目的基因片段，合成阳性质粒，质粒大小为bp，质量浓度为32.55ng/μL。流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金*色葡萄球菌和临床DNA样品等的核酸DNA，由本实验室提取并保存。方法引物和反应条件。使用PrimerExplorerV4软件设计6组引物组合：组合1，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-1FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；组合2，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-2FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；组合3，包括CH-1OF、CH-3OB、CH-1FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；组合4，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-4FIP、CH-1BIP、CH-1LF、CH-1LB；组合5，包括CH-1OF、CH-1OB、CH-1FIP、CH-5BIP、CH-1LF、CH-1LB；组合6，包括CH-6OF、CH-6OB、CH-6FIP、CH-6BIP、CH-6LF、CH-6LB（表1）。将引物进一步通过NCBI的BLAST进行序列比对分析，比较设计的引物序列与主要病原菌（流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、金*色葡萄球菌）的序列匹配度，确定引物的特异性。引物筛选。通过试验筛选最优反应条件，反应总体系约为25L，其中反应缓冲液12.5μL、引物1μL、聚合酶1μL、荧光染料0.5μL、RNaseFreedH2O8.0μL、DNA模板2μL。反应体系配好后加入甘油0.25μL，然后63℃下恒温扩增1h。以标准质粒作为模板阳性对照，双蒸水作为阴性对照进行引物筛选；阴阳对照各做2个重复，选取反应条件最优的作为最优引物。特异性试验。应用上述筛选出的最优引物，以流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金*色葡萄球菌等病原菌核酸作为模板进行扩增，评价该方法的特异性。敏感性试验。以标准核酸为母液，将其稀释为1×拷贝/μL后，再连续进行10倍倍比稀释，依次取~拷贝/μL为模板，应用上述筛选出的最优引物进行扩增，评价该方法的敏感性。临床样品检测。对实验室保存的34份从鸡咽喉和泄殖腔拭子中提取的DNA样品进行检测。结果
引物筛选本研究设计了6组引物探针组合，先经BLAST比对分析，并与常见病原菌（流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金*色葡萄球菌）序列进行比对分析，结果显示特异性良好。通过试验筛选最优引物，结果显示6组引物中，组合1起峰时间早、荧光强度值高、重复性和特异性最好，故组合1最优（图1）。特异性试验提取流产衣原体、动物布鲁氏菌、牛结核分枝杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金*色葡萄球菌等的核酸作为模板，以标准核酸为阳性对照，对引物组合1进行特异性试验。结果（图2）显示，引物组合1特异性较好。灵敏度试验取原浓度标准品进行梯度稀释，依次取~拷贝/μL为模板，对稀释后的各浓度梯度进行检测，每个梯度做2次重复，结果显示该方法的灵敏度为拷贝/μL（图3）。临床样品检测用建立的方法（LAMP）与QPCR方法同时对实验室保存的临床DNA样品进行检测。结果（图4）显示，34份临床样品中，LAMP和QPCR均检测到1份阳性，其余为阴性，符合率为%。讨论
在我国，鹦鹉热衣原体被列为三类动物病原微生物，其宿主广泛，感染性强，可通过呼吸道或直接接触传播。目前实验室诊断常用的方法中，鸡胚培养或细胞培养对实验室生物安全条件要求较高，且不易分离到病原；补体结合试验和间接血凝试验操作步骤比较繁琐，容易出现结果偏差；荧光定量PCR和基因芯片等试验则需要昂贵的仪器，成本较高。随着分子生物学和免疫学技术的飞速发展，环介导等温扩增技术、重组酶介导链替换核酸扩增技术、重组酶聚合酶扩增技术和胶体金等检测方法越来越成熟，已有很多被应用到人兽共患病的诊断中。加强鹦鹉热衣原体新型诊断技术的研发与应用，必将为该病的快速、高效诊断和防控奠定基础。LAMP检测方法是由日本科学家开发的，也被国内很多学者应用到各种疫病的检测中。但这些方法往往需要借助肉眼观察颜色变化以及凝胶电泳实验或浊度仪等判读结果，容易出现结果偏差，而且无法有效避免开盖污染产生的假阳性。本研究建立的基于恒温荧光技术的现场快速检测诊断技术，适用于基层和现场快速筛查病原。该技术能在63℃恒温条件下1h内即可显示结果，操作简单、快速，特异性强，灵敏度可达拷贝/μL。此外，该技术用国产仪器通过直接检测荧光信号判读结果，既增强了准确性，也避免了开盖污染产生假阳性。该方法的建立弥补了传统检测技术的不足，也为实现鹦鹉热衣原体的现场快速诊断提供了技术支持。应用建立的LAMP方法对实验室保存的临床DNA样品进行检测，发现与QPCR检测的结果相同，说明该方法可用于临床检测。《鹦鹉热衣原体荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法的建立》详情