小新壳梭孢真菌（Neofusicoccumparvum）是一种能导致葡萄枯枝病的葡萄座腔菌科真菌（Fig.1A），会引起枝条枯萎、枝干溃疡、枝干木质部坏死等症状（Fig.1B），严重时甚至可以引起整个植株死亡，在世界范围内广为传播。为了探寻N.parvum感染木质部以及分泌对植物有*化合物的机理，研究人员对该真菌进行三代基因组测序以及RNA-Seq，深入分析了N.parvum次生细胞壁降解、*力因子表达等问题。
Fig.1A)NeofusicoccumparvumB)受侵染的葡萄枝干，感染部位成V型
测序策略
1.基因组测序：预估基因组大小为44.2Mb，基于PacBioRSⅡ平台，P6C4，上机9个SMRTcell，基因组覆盖度×。
2.基因组测序验证：IlluminaHiSeq测序，Paired-end-bp，基因组覆盖度50×。
3.二代转录组测序：IlluminaHiSeq测序，paired-end-bp，single-end50-bp。
组装结果
组装出的N.parvumUCDSo基因组近完成图，包含28个Contigs，其中的1个Contig覆盖了完整的线粒体基因组（长度为.8kb），其余的27个Contigs组装出43.7Mb核基因组，占预估基因组大小的98.9%，ContigN50高达2.5Mb（Table1）。而之前研究中使用Illumina短读长数据组装出的基因组草图中Contig数量高达1,个s(1,个Scaffolds)。
Table1N.parvumUCDSo基因组组装注释结果
通过分析端粒TTAGGG重复，发现有16个Contigs覆盖了整条染色体(端粒-端粒)，有2个Contigs组装出一个端粒。上述18个Contigs覆盖了99.1%的基因组。
Fig.2N.parvum基因组图谱
对N.parvumUCDSo使用IlluminaHiSeq进行测序，结果与PacBio数据进行比较，两者之间存在个位点的差异。假设Illumina数据是准确的，那么PacBio数据的准确率为99.%。
以上分析结果可以看到，相对短读长测序的碎片化的组装结果，PacBioSMRT测序能获得真菌基因组的近完成图，并且组装结果准确、连续和完整，是真菌基因组测序组装的首选。
科学问题探索1.假定的*力因子相关基因注释
根据前人研究分析得知，N.parvum致病机理及*性可能与以下因素相关：(i)木质降解及入侵，如碳水化合物活性酶（CAZyme）、过氧化物酶、P等；(ii)细胞转运蛋白；(iii)次生代谢（包括*素产生）。
本研究注释出转录本中有52%（6,个基因），与以上这些功能相关。研究人员共找到个分属于52个CAZyme基因家族的基因，它们可能与降解初级和次级植物细胞壁相关（Fig.3）。丰度最高的基因家族是与分解半纤维素相关，包括42个葡糖苷酶（GH3s），23个纤维素酶（GH5s）、32个木葡聚糖内切-β-1,4-葡聚糖酶（GH16s）和31个GH43s。
Fig.3N.parvum基因组中假定的细胞壁降解酶类编码基因
2.不同的培养基质引起的与*力相关联基因的主要的转录组变化
设定三种不同的培养基质作为N.parvum的碳源：混合了赤霞珠葡萄树枝磨成的粉的琼脂、混合了梅洛葡萄树枝磨成的粉的琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂。分别收集三种培养基上的菌丝，进行RNA-seq，并与N.parvumUCDSo的转录组数据进行比对分析，发现有1,个基因在生长于混有树枝粉的培养基的菌丝中是表达上调的，其中有73个基因可能属于CAZymes，与降解宿主细胞壁相关。
3.在葡萄树木质茎受感染的过程中，*力因子转录组研究
在侵染的过程中，取7个时间点分别进行RNA-Seq，研究人员注释了78个差异性表达的基因，根据表达峰值出现的时间将其分为四类（Fig.4）。
以Group1为例，其中含有五个细胞壁降解酶类编码基因，两个与纤维素和木聚糖/木葡聚糖骨架分解相关的基因，一个GMC氧化还原酶基因等等，它们在24hpi时出现表达峰值，多与细胞壁降解、营养储存相关，有助于N.parvum的早期发育（Fig.5）。随着入侵的深入，基因表达转向Group2，以生物合成为主，次生代谢相关基因占主导。
Fig.4将78个差异性表达基因根据K值聚类分析分为四个种类，分别在不同时期出现表达峰值。
Fig.5以Group1为例，其中与次生代谢相关的共表达基因簇
粉色：聚酮合酶相关基因；蓝色：P相关基因；*色：转运蛋白相关基因；橙色：FAD结合蛋白相关基因
4.共表达网络分析识别基因组中共调节的*力因子
N.parvum入侵葡萄树枝木质部是一个动态的过程，在感染不同时期，N.parvum转录组调节机制受环境和转录因子调控，实现时间空间上的精准表达。本研究构建了整个基因表达网络以进一步研究共表达和共调控，以鉴定出共享表达模式和启动机制的共表达基因（Fig.6A）。
Fig.6N.parvum共表达网络分析
A基于相异性测量的转录本聚类树状图，每根线代表一个基因，下方multi-colorbar为对应的40个基因模块；B展示了在共表达模块中每个基因组聚类里的相邻的共表达基因数量；C基因功能种类分布，带*为*力类显著过表达；D基因组聚类中，带有共同启动机制数量与所占半分比情况
在研究发现，涉及到细胞壁降解和次生代谢的基因功能受到受体内木质的影响，尤其是在侵染过程中表现尤为明显。这种条件依赖型基因表达调控主要是通过物理聚簇基因的共表达实现，大多数共表达的基因簇共享至少一个启动子基序，表明它们由共同的转录因子调节。共表达分析显示了转录因子和染色质对潜在*力因子的多层复杂调节。
研究者通过PacBio测序组装获得真菌基因组近完成图，从中挖掘*力因子相关基因，经转录组分析，从基因表达水平对*力因子相关基因进行研究，从而深入探究目标科学问题。作为中国首家第三代测序服务公司，未来组于年就开始推广和运用第三代PacBio测序技术在真菌基因组中的应用，目前已积累了上百个三代真菌基因组测序组装项目经验，同时，未来组Sequel平台已稳定高效运行（详情点击），将会提供更具性价比的基因组测序分析服务。
未来组真菌基因组组装典型案例
参考文献
MélanieMassonnet，etal..Condition-dependentco-regulationofgenomicclustersofvirulencefactorsinthegrapevinetrunkpathogenNeofusicoccumparvum.MolecularPlantPathology.
武汉未来组生物科技有限公司（NextomicsBiosciences）成立于年8月8日，总部位于武汉光谷生物城，目前在北京生命科学园和美国纽约设立有分支机构，是中国首家第三代测序服务公司。
武汉未来组通过三代测序生物信息学工具和流程的开发，解决了复杂基因组组装、微生物完成图组装、全长转录组分析、人类基因组变异检测等领域的技术瓶颈，推动了基因组学研究的升级换代，目前已经完成数百个三代测序科研项目，发表了多篇三代测序的科学文献。因为专注于三代测序技术开发和应用推广，武汉未来组已经成为中国三代测序技术应用的第一品牌。
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