练光辉刘哲卢放根
［摘要］目的通过建立DSS诱导的恢复期UC小鼠模型，探讨青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌维持UC缓解的作用。方法6-8周龄雌性BABL/c小鼠50只，体重(士2O)g,随机分为5组正常对照组、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌组、柳氮磺胺咄唗组和生理盐水对照组，每组10只。除正常对照组外，采用自由饮用2.5%DSS(相对分子质量3.6万-5万）7d建立小鼠UC模型，并从实验第Id开始，给予青春双歧杆菌、嗜酸乳杆菌（浓度均为2xI08CFU/IOg)和SASP(I5mg/IOg)灌肠治疗I7d,观察小鼠一般情况、粪便隐血,计算疾病活动指数(DAI),实验结束时处死动物，测量全段结肠长度、行组织病理学检查并进行组织学评分。结果青春双歧杆菌、嗜酸乳酸杆均能维持实验性结肠炎的缓解，从第IOd开始其DAI积分均明显小于生理盐水对照组(PO05),而且青春双歧杆菌有利于体重恢复，在第11d开始体重迅速增加；嗜酸乳酸杆菌在组织学改善方面效果更显著。结论青春双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌能有效地维持实验性结肠炎的缓解，而且两者的作用有所差别。
［关键词］溃疡性结肠炎恢复期，双歧杆菌；嗜酸乳酸杆；治疗
[Abstract]ObjectiveToestablishDSS-inducedconvalescentulcerativecolitis(UC)modelsandtheninvestigatetheeffectofB.adolescentisandL.acidophilusonUC.Methods50specificpathogenfree,(2±2)g,6-8week-oldBALB/cfemaIemicewererandomlyallocatedin5groups:normalcontrolgroup(N),L.acidophilus-treatedgroup(L),B.adolescentis-treatedgroup(B),SASP-treatedgroup(S),NScontrolgroup(NS).Withtheexceptionofnormalcontrolmice,40BABL/cmicewereinducedby2.5%DSSwaterfor7daysfreedrinkingand10daysdistilledwater.Themiceweregiven0.2mlB.adolescentis/L.acidophilus/SASP/NSviagavageonceadayfor17days,whilenormalcontrolsletuntreated.Theanimalwererecordeddailybothweight,fecaltraitandbleeding(o-toluidine),andthendiseaseactiveindex(DAI)wasaccounted.Theanimalswerekilledon18thdaymorning.Thewholecolon(fromthecolo-cecaljunctiontotheanus)wasisolatedforexaminationoflengthandpiecesforhematoxylinandeosinstain,andhistologyscoresweremeasured.ResultsB.adolescentisandL.acidophiluscouldrelievepathogeneticconditionofDSS-inducedmice.TheDAIandhistologyscoresofmicetreatedwithprobioticsweremuchlowerthanthosedidnotfromdayIO(P0.05).B.adolescentiswasfoundmoreeffectiveonprotectingweightlossfromlOhday,whileL.acidophilusbetteronmucosaprotection.ConclusionTheB.adolescentisandL.acidophiluscanmaintainremissionofUC,andtheeffectofthetwostainsarelittledifferent.
[Keywords]ulcerativecolitis;convalescent;bifidobacterium;lactobacillus;treatment
溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性复发性疾病，其病因和复发机制尚不清楚，但研究发现与肠道内菌群有密切的关系。致病菌的过量繁殖可以使肠道抗原谱发生改变，从而启动炎症反应，而粘膜的炎性损伤又为致病菌进入机体引起复发提供条件。因此通过补充肠道益生菌抑制和／或杀灭致病细菌，重建肠道的微生态环境可能有利于UC的持续缓解。
目前常用的化学诱导和免疫诱导的动物研究模型大多数为急性期的炎症，不能如实反映疾病的整个过程。本研究通过7dDSS饮用诱导出急性期UC模型以及延长10d观察急性后期的恢复期小鼠模型，综合观察疾病活动、结肠组织损伤等情况，分析青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌对小鼠模型疾病发展和转归的影响，评价青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌对DSS诱导的UC恢复期动物模型的治疗价值。
1.材料与方法
1.1材料
DSS分子量,购自Sigma公司，用生理盐水配制成2.5%浓度；SASP由上海福达药物有限公司生产，辗碎后用生理盐水稀释成20mg/ml浓度；青春双歧杆菌BF和嗜酸乳酸杆菌LT为湖南康哲中南医药研究有限公司提供，培养液离心后用生理盐水均稀释成1xl09CFU/ml浓度。
1.2方法
1.2.1实验动物及分组
Balb/c小鼠，SPF级，雌性，6-8周龄，体重(20.0土2.0)g,随机分成5组，每组10只，分组情况如下：正常组(N):正常饮食饮水；生理盐水对照组(NS):DSS7d造模＋无菌生理盐水(NS)灌肠17d15-氨基水杨酸组(SASP):DSS7d造模+SASP(I.5g/kg)灌肠17d,青春双歧杆菌组(B):DSS7天造模+IxCFU/mlB.adolescentis菌液灌肠17d,嗜酸乳杆菌组(L):DSS造模+Ixl09CFU/mlL.acidophilus菌液灌肠。
1.2.2动物处理
按张艳丽方法，前7d自由饮用2.5%DSS溶液造成溃疡性结肠炎模型，然后继续正常饮水10d,正常组一直予以正常饮食饮水.实验第Id起给予无菌生理盐水、SASP、B.adolescentis菌液、L.acidophilus菌液等灌胃，每只小鼠每天灌肠l次，每次0.2ml/10g,共17d。每天测量动物体重，记录大便性状和隐血情况，计算DAI积分。第18d,颈椎脱臼处死小鼠，游离结肠和远端回肠，取出肛门至盲肠末端的整个结肠和直肠段，观察各组小鼠结肠的大体改变、测量整个结肠长度。用预冷无菌生理盐水将结肠冲洗干净，分别于结肠末端（距肛门1cm)处剪取0.5cm长结肠，福尔马林浸泡，石蜡包埋、切片，HE染色做病理检查。
1.3统计学方法
各组小鼠体重改变、结肠长度、疾病活动指数(DAI)和组织学损伤评分结果数据均以均数土标准差(Mean士SD)形式表示，对计量治疗进行方差齐性检验后，组间比较采用方差分析(one-wayANOVA)检验，经SPSSl1.5统计软件处理，以P0.05差异有统计学意义。
2.结果
2.1体重变化
正常小鼠体重在实验期间缓慢增加，而饮用DSS小鼠体重均有下降，而且在停止饮用DSS小鼠NS组体重继续降低，L组在急性期第5d出现体重回升后第8d体重再次出现下降，在实验第lOd除正常组小鼠以外各组体重降至最低值，而后各治疗组小鼠体重均开始回升，其中B组小鼠体重增加最快，至实验第17dL组及B组体重与SASP组和NS组比较均有显著性差异(P0.05),见图l。
2.2小鼠的疾病活力指数(DAI)积分
饮用DSS小鼠从第3d开始出现大便隐血阳性，DAI积分均见不同程度的增加，停止饮用DSS后DAI积分继续缓慢增高，各组在实验第lOdDAI积分出现一次高峰，而后L组积分缓慢下降，后稳定于较低的1.30-1.40;而B-组动物在第lld以后积分迅速降低；至实验结束时B组DAI积分低至(0.80±0.36),各治疗组动物DAI积分与NS组有显著性差别(P0.05),而B组及L组亦低于SASP组(P0.05)。
2.3小鼠结肠长度变化
饮用DSS小鼠结肠长度较正常小鼠缩短，其中SASP组小鼠结肠长度稍长于NS组(9.91士3.66vs9.54士2.07),但没有显著性差别，L组(11.24士l.52)和B组(lo.83士2.95)小鼠结肠缩短比较NS组明显减少，与NS组比较有显著性差别(P0.05)。
2.4小鼠结肠病理组织学
NS组小鼠在恢复期结肠组织学见炎症累及粘膜基底层，表现为广泛的粘膜、腺体缺损，隐窝破坏和大量的炎性细胞浸润。SASP、L．acidophilu和B.adolescenti治疗后，小鼠结肠粘膜缺损部分修复，隐窝破坏减少，炎性细胞浸润减轻，炎症深度约为粘膜全层1／3～2／3；组织学评分S组、L组和B组与NS组有显著差~ll(PO．05)；而L．acidophilu治疗效果优于B．adolescenti和SASP，组织学评分与之有差别(P0．05)。
3.讨论
溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性复发性疾病，其病程呈现一种“活动一缓解一复发”的过程，人们建立了许多与人类UC病理学特征相似的动物模型进行实验研究，希望通过动物实验的研究进一步探讨其病理生理机制。目前对实验性UC的研究主要集中在研究动物模型疾病急性期的改变以及药物对其产生的干预，对占大部分疾病时间的恢复期以及复发的研究报道较少。多个实验结果表明益生菌在诱导UC缓解的补充治疗方面的确能起一定的作用，能减轻疾病的严重程度；但是由于目前的研究集中在比较益生菌与经典治疗药物临床疗效的比较，对于益生菌在UC恢复期的作用和维持UC缓解，减少复发方面的研究较少，另外由于菌群构成的复杂性和各种细菌在结肠的优势定植部位、分泌产物以及对肠内容物或有毒物质的代谢等不同，造成某些“益生菌”并不能产生应有的效果。鉴于此，将饮用7dDSS的小鼠停止给于DSS后继续观察lOd，把这段时间看作为UC急性期后的恢复期，研究两种不同益生菌(青春双歧杆菌和嗜酸乳杆菌)在UC恢复期的维持缓解效果。
经2株菌治疗的动物其体重下降较为缓慢，B组动物在第11d体重迅速增加，远远超过其他各组增加量，Rembcken等I使用非致病大肠杆菌治疗UC动物对体重下降控制晚于青春双歧杆菌，在实验结束时其效果亦逊色于青春双歧杆菌。由于不同的益生菌在结肠的定植能力、产生的代谢产物以及对有害物质的分解能力等都有一定的差别，是否为益生菌对UC动物体重下降保护存在差异的原因。将体重变化、大便性状改变和粪便隐血情况作为指标得到DAI积分可以反映实验动物UC的病情。实验动物在饮用DSS后2～3d均出现不同程度的腹泻、大便隐血阳性，益生菌治疗动物粪便性状在第13d基本恢复正常，大便隐血消失。各组动物在第1OdDAI积分达到一个高值，而后各治疗组呈一个下降趋势，L组呈现峰值不高，下降也较为缓慢的曲线；而B组动物在第lOd达到较高的峰值后积分迅速降低，至实验结束时B组动物积分反而最低，两组益生菌治疗组与SASP组比较也有明显差异，这可能与益生菌有促进动物食欲效果导致动物体重迅速增加，DAI积分下降有一定关系。
由于肠粘膜炎性坏死溃疡形成导致结肠缩短，这些改变客观的反映了肠组织的损伤程度。饮用DSS／J~鼠结肠长度均较正常小鼠缩短，但青春双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌可以阻止结肠的缩短，这可能与益生菌减少肠道炎症，减少疤痕形成有关。病理组织学方面，各组小鼠结肠大体较呈现肠腔内少量积血，镜下见隐窝和腺体有不同程度的破坏，但炎性细胞浸润较为明显。益生菌和SASP治疗组可以恢复肠粘膜完整性，减少肠道出血和炎性细胞的浸润，动物组织学评分比较NS组均有降低其中益生菌的效果要强于SASP，而其中嗜酸乳酸杆菌对结肠组织损伤的改善却是最强的。青春双歧杆菌和嗜酸乳酸杆菌在症状及组织学改善作用产生的时间不对称性可能由于酸乳杆菌是结肠的主要栖生菌，补充嗜酸乳酸杆菌能更快的定植于结肠粘膜，其产生的代谢产物使结肠更迅速的接近于正常的微生物稳态，致使症状首先获得改善；然而青春双歧杆菌对结肠其他一些益生菌有促进生长繁殖作用，在中期大量繁殖的益生菌可能超过体外补充细菌量，致使青春双歧杆菌组动物症状迅速得到控制；而在后期，益生菌之间相互作用使各种细菌达到稳定状态，因此两种益生菌组动物症状和组织学均得到改善。但在更长期的缓解期，2种益生菌是否在症状和组织学改善能力上有差别应进行更进一步的研究。
参考文献
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本文转载于当代医学当代医学年8月第16卷第22期总第期ContemporaryMedicine，Aug．，Vo1．16No．22IssueNo．