许多对人类健康至关重要的肠道微生物依靠彼此产生的营养物质生存；然而，这些交叉喂养的相互作用仍然很难量化，而且特征仍然很差。在这里，我们介绍了一个代谢物交换分数（MES）来量化这些相互作用。使用来自多个个体的原核宏基因组组装基因的代谢模型，MES使我们能够识别和排序11种疾病中10种疾病中受交叉喂养伙伴缺失显著影响的代谢相互作用。当应用于克罗恩病病例对照研究时，我们的方法确定缺乏能够消耗硫化氢的物种是疾病的主要区别微生物组特征。我们提出，我们的概念框架将有助于优先考虑深入分析、实验和临床目标，以恢复微生物交叉喂养的相互作用为目标来重建健康的肠道生态系统。
引言人体肠道包含数百种微生物，形成一个复杂而相互依存的代谢网络。肠道微生物消耗的代谢物中有一半以上是微生物代谢的副产物，其中一个物种的废物为其他物种提供营养。物种间的相互依赖会使微生物在失去一个伙伴后很容易在当地灭绝，除非有替代物种来填补这个生态位。在这种情况下，拥有能够生产或消耗相同营养物质的功能冗余物种对宿主是有益的。虽然人们普遍认为，高功能冗余是有弹性的人类肠道微生物群的一个特征，但代谢相互作用中冗余对人类健康的影响在很大程度上仍未被描述。恢复交叉喂养的微生物伙伴的多样性是一个合乎逻辑的，但在很大程度上仍是未被探索的主题，以对抗与肠道微生物群不平衡相关的广泛疾病。
在计算机中模拟微生物代谢的机械模型有望填补我们在微生物代谢相互作用方面的知识空白。基因组规模的代谢模型（GEMs）基于越来越全面的数据库，将基因与生化和生理过程联系起来。十多年来，这些模型一直被用于估计成对细菌之间的代谢交换。GEMs重建自动化的发展，以及数千个肠道微生物手动策划的GEMs的可用性，为建立复杂微生物群落的代谢模型铺平了道路。方法学的进步现在允许对多个物种之间的相互作用进行建模，Zorrilla及其同事最近开发的工作流程现在允许直接从大规模宏基因组数据集重建代谢模型。使用社区代谢模型的研究发现，与健康对照组相比，炎症性肠病的代谢有几十到数百种显著不同。基于生态学的框架对这些代谢相互作用进行排序的方法提供了产生肠道微生物组和疾病之间潜在机制联系的有针对性的假设的机会。
在这里，我们介绍了一个源自宏基因组代谢模型的代谢物交换评分系统，旨在识别在疾病中受影响最大的潜在微生物交叉摄食相互作用。将我们的概念框架应用于包含15个国家和11种疾病表型的个公开可用的粪便宏基因组的集成数据集。我们的框架确定了已知的和新的微生物组疾病关联，包括结直肠癌和乙醇微生物代谢之间的联系，类风湿关节炎与微生物衍生的核糖基烟酰胺之间的联系，克罗恩病与代谢硫化氢的特定细菌之间的联系。该评分系统可以帮助量化和识别微生物相互作用的环境依赖性破坏，这可能是基于微生物组的药物的目标。
结果1、潜在交叉喂养相互作用的定量
为了理解交叉喂养相互作用和疾病之间的联系，我们设计了代谢物交换评分（MES）。MES是指给定代谢物的消费者和生产者的多样性的乘积，除以参与的总物种数（图1a和方法）。通过代谢建模，估计每个微生物成员的代谢物的潜在生产、消耗和交换，前提是可以重建MAGs。就像网络的中心性度量定义了它们最连接的节点一样，MES高的代谢物可能是微生物食物链中的关键成分。另一个极端，MES为零的代谢物是没有任何群落成员生产或消耗的。通过比较健康和病态微生物组中每种代谢物的MES，可以对代谢物进行排序和识别，找出哪些代谢物最受交叉喂养伙伴丧失的影响（图1b）。一旦用MES对代谢物进行了优先排序，就可以结合物种丰度和它们估计的代谢通量，找出作为目标代谢物的主要生产者或消费者的物种组合。我们提出这种方法作为一种假设生成策略，以指导新的发现、有针对性的实验和临床试验。
图1代谢物交换分数（MES）计算与应用简图。a)MES是指根据基因组信息的代谢模型推断出的潜在生产者（P）和消费者（C）的数量的调和平均数；b)健康和病态群体之间的MES的比较分析可以帮助识别恢复交叉喂养相互作用所需的物种和代谢物，这些物种和代谢物可能是微生物组治疗的有前途的靶点。
2、个微生物组的荟萃分析揭示了肠道微生物在健康和疾病中的关键代谢相互作用
为了获得交叉喂养相互作用与不同疾病之间关联的概览，我们对个高质量和深度测序的肠道宏基因组样本进行了大规模分析，包括个健康人和个患病人，来自33个发表的研究，15个国家和11种疾病表型（补充数据1）。整合研究使得能够组装出肠道微生物的元基因组组装基因组（MAGs），并允许在健康人群中表征基线MESs。我们的健康队伍由男性和女性组成，体重指数（BMI）在18.5和24.9之间，没有报告过任何疾病。对于这些信息不清楚的样本（例如，未报告健康状况或BMI的疾病对照），我们的数据集中不包括（详见方法）。在样本序列组装，宏基因组共分箱和质量控制的结果是55,个箱，包括24,个高质量的MAGs，完整度90%和0.05%的污染。我们选择了每个物种的一个代表性MAG，定义为95%的平均核苷酸同一性（ANI），结果是种细菌和6种古菌物种，涵盖了肠道中发现的所有主要的微生物门（图2a，补充数据2）。通过将序列读取映射到个MAGs来确定这些物种的存在和丰度。40种细菌和一种古菌物种只在患病个体中发现（补充数据3a），而健康个体中含有59种细菌和一种古菌物种，这些物种在任何患病个体中都没有观察到（补充数据3b）。在宏基因组样本中识别物种仍然是一个挑战，尽管我们在这里使用了大数据集进行共分箱，但我们的MAGs基于的方法可能会错过肠道微生物组的稀有成分。为了推断微生物之间的代谢交换，我们为个MAGs重建了基因组规模模型（GEMs），根据物种水平的丰度使用MICOM建立了每个个体的社区规模的代谢模型，并使用自定义脚本计算MES。我们的模型社区包含平均种物种（最小=34，最大=种物种）。
我们首先试图通过分析整个健康群体中每种代谢物的MESs，来确定健康微生物组中具有最高多样性的交叉喂养伙伴的代谢交换。代谢物在个体之间显示出MESs的广泛变化（图2b，图S1）。平均MES最高的代谢物包括核苷酸，如尿嘧啶（MES平均值和标准差=60.5±17.6）和胸腺嘧啶（41.8±21.8），必需营养素，如磷酸盐（59.9±17.0）和铁（40.3±36.9），以及糖类，如葡萄糖（52.6±22.1）和半乳糖（52.3±21.3）。
为了确定在疾病过程中由于交叉喂养伙伴的丢失而受到最大影响的代谢物，我们比较了健康组和11种疾病表型之间的MESs。这一分析发现，除了精神分裂症外，所有疾病组中都有特定代谢物的交叉喂养伙伴显著减少（图2c，图S2）。在健康个体中MESs较高且已知对人类健康重要的代谢物，如维生素B1（硫胺素）和短链脂肪酸的前体（如苹果酸、葡萄糖、半乳糖），在多种疾病表型中受到显著影响（Kruskal–Wallis’p0.05/测试次数以校正多重比较）。硫胺素是在肝硬化和强直性脊柱炎中健康和患病微生物组之间MESs差异最大的代谢物，排名第二的是炎症性肠病（IBD）（图2c）。硫胺素缺乏与肝硬化和IBD的关联已经被报道，但据我们所知，这是对这种表型可能存在微生物介导的第一个迹象。同样，这也是对微生物衍生的核糖基烟酰胺和类风湿性关节炎之间的联系的第一个迹象（图2c）。结果还证实了以前报道的微生物介导的疾病代谢物关联，如乙醇在结直肠癌和硫化氢在IBD中的作用，强化了我们新方法识别合理关系的潜力。
图2全面分析揭示了健康肠道微生物之间最常见的代谢交换和交叉喂养伙伴的疾病特异性丧失。a)所有样本中物种水平MAG的流行率；b)健康个体中MES最高的前15种代谢产物，预计它们将是维持健康微生物群落结构必需的；c)与健康组相比，患病微生物组中MES显著降低的代谢产物，表明这些代谢产物的微生物交叉喂养伙伴显著减少。
我们接下来将我们的结果与Zorrilla等人的研究进行了比较，他们使用了SMETANA来量化肠道中的微生物代谢交换，并将其与葡萄糖耐受不良和2型糖尿病（T2D）联系起来。他们的研究发现了22种代谢物的交换有显著差异，其中包括硫化氢（H2S）和D-半乳糖，这些代谢物也在我们的分析中被鉴定为在与T2D相关的微生物组中具有显著更高的MES，与健康微生物组相比（补充数据4）。我们的结果在鉴定肠道细菌之间最频繁交换的代谢物方面也有一些一致性，其中Zorrilla等人（参考文献19中的图3a）强调的六种代谢物中的三种，是健康微生物组中MES最高的15种代谢物之一（L-苹果酸，H2S和乙醛）。
3、物种多样性与交换代谢物的生产者和消费者之间有着不同的关系
肠道群落中的微生物物种多样性通常被认为是健康状况的一个标志。与五种疾病相关的微生物组在各种指数（香农指数和物种丰富度）上显示出显著而一致的α多样性降低，而与2型糖尿病患者相关的微生物组与健康组相比则具有显著更高的α多样性（图S3）。与物种多样性低（例如，炎症性肠病）相关的疾病显示出MES差异的最大幅度（图2c），这是可以预期的，因为交换代谢物的微生物物种的数量与群落中的物种数量自然相关。
为了进一步理解多样性和代谢物交换之间的关系，我们检验了生产者和消费者同样受到物种多样性影响的零假设。具体而言，我们将每种代谢物的生产者或消费者物种的数量与物种丰富度相关联，以确定代谢物生产和消费的这些相关性斜率之间的统计差异。零假设（斜率之间没有统计差异）意味着生产者物种和消费者物种的数量随着物种丰富度的增加而以相同的速度增加。这样的结果意味着交叉喂养的相互作用只取决于群落中存在的物种数量。对于肠道微生物组交换的79%的代谢物，这一无效假设被拒绝（图3a，补充数据5），消费者（55%的代谢物）或生产者（24%的代谢物）的相关性斜率明显更陡。从具有最高MES的代谢物中，只有甘油的生产者和消费者对物种丰富度的反应没有显著差异（图第3b–p段）。
图3生产者对消费者的动态受大多数代谢物物种丰富度的影响。a)大多数代谢物的物种丰富度斜率与生产者或消费者相关性之间存在显著差异，24%的代谢物的生产者斜率更陡，55%的分析代谢物的消费者斜率更陡。b）健康微生物群中MES最高的前15种代谢物的物种多样性与生产者或消费者之间的相关性。
4、微生物食物网修复是克罗恩病的一种潜在治疗策略
为了探索如何应用MES和我们的建模框架来指导有前景的治疗靶点的鉴定，我们将重点放在了克罗恩病（CD），一种IBD的形式。我们选择了一个单一的病例对照研究，该研究在我们的质量控制数据集中包含了最多的健康和患病个体的样本，以最小化批次效应。与全球分析一致，我们发现H2S--一种先前与CD和IBD症状相关的气体——是受到交叉喂养微生物伙伴丧失影响最大的代谢物（降低了两倍，补充数据6）。虽然肠道微生物组产生H2S的研究已经有了几项（例如，参考文献35,36），但是这种气体的消耗却较少被描述，我们的建模结果表明，细菌消耗的H2S可以被合成为含硫氨基酸，如半胱氨酸（图S4）。
将重点放在H2S上，我们发现健康个体的微生物组包含了更多具有产生H2S潜力的物种，以及更多具有消耗H2S潜力的物种，比如与CD相关的微生物组（图4a）。有趣的是，潜在的H2S消费者的多样性在CD患者中受到的影响更大（平均减少了56%，补充数据7），而H2S生产者的多样性受到的影响较小（减少了32%），导致CD患者中H2S生产者与消费者的比例显著更高（图4c）。当我们研究微生物之间的H2S流动时，也观察到了类似的结果。在疾病状态下，微生物组消耗H2S的总估计能力降低了74%，而总产量没有显著受到影响，导致CD中H2S的产量与消耗量的比例更高（图4b，d，补充数据7）。H2S的过剩（即预测输出到培养基的H2S）在健康和患病的受试者之间没有显著差异（Kruskal–Wallisχ2(1)=0.,p=0.）。在校正了物种多样性的混杂效应后，H2S消费者比H2S生产者在CD中受到的影响更大的迹象仍然存在，尽管微生物之间交换的H2S的流量没有观察到显著差异（补充数据8）。
为了更好地理解代谢建模结果的遗传基础，我们研究了在CD病例对照研究中存在的MAGs中涉及H2S循环的46个已知基因的分布。我们发现每个MAG中有1到23个基因（补充数据9）。五个参与H2S循环的基因在与健康个体相关的微生物组中更为普遍（补充数据10）：cysK，dcm，Fuso_cyst，metH和metK（线性模型，使用物种多样性作为混杂变量，并使用双向t检验来评估显著性，p0.，考虑多重比较）。另外五个基因在与CD相关的微生物组中更为普遍：asrA，asrB，asrC，dmsA和dsrC（p0.），前四个基因在考虑物种丰度时也显著富集（补充数据10）。
为了确定与CD中H2S失衡相关的关键物种，我们比较了每个物种对健康和CD队列中总H2S产生或消耗的贡献。对于每个物种，我们估计了H2S的流量（按相对丰度加权），并计算了健康和CD个体中总H2S加权流量的差异。在CD患者中，向H2S产生方向增加最多的物种包括了Clostridia，Bacteroidia和Bacilli类的成员（图4e，补充数据11）。Enteroclosterclostridioformis（Clostridia）和Enterococcus_Bfaecium（Bacilli）只在CD队列中观察到。许多物种（病例对照研究中的45%的MAGs）根据模型显示了既能产生又能消耗H2S的能力，而它们的作用取决于它们的群落环境。Phocaeicoladorei（Bacteroidia）是在健康和CD个体之间预测的H2S产量差异最大的物种，尽管它在两个队列中都很常见。我们在这个物种中发现了多个与H2S代谢相关的基因（cysK，bsh，dcm，Fusocyst，luxS，metK，sufS，以及两个malY和metH基因的拷贝）。Clostridia类的成员是在CD微生物组中H2S消耗量降低最多的H2S消费者，包括Roseburiaintestinalis，Blautia_Aobeum，和两个Faecalibacterium物种（F.prausnitzii_J和F.sp）（图4e，补充数据11）。前5名消费者物种有2到4个半胱氨酸脱硫酶（iscS）基因的拷贝，除此之外还有一系列其他参与H2S代谢的基因（补充数据9和11）。
我们接下来将我们的代谢建模方法得到的结果与传统的组成型微生物组分析进行了比较。使用主成分分析可视化了群落的β多样性，显示与CD相关的微生物组形成了一个独特的聚类（图S5a）。为了确定哪些物种对这些差异贡献最大，我们使用了一个随机森林（RF）分类器（70%的数据用于训练，30%用于测试）。训练数据集的袋外错误率为9.52%，测试数据集的准确率为%。通过它们的重要性分数，我们确定了在健康和CD相关的微生物组之间产生最大差异的物种（图S5b）。RF分析鉴定的一些物种也被我们的代谢建模方法鉴定，包括H2S消费者Roseburiaintestinalis，Escherichiacoli和Anaerostipeshadrus，以及H2S生产者Clostridium_Qsymbiosum。我们的建模方法鉴定的20个物种中有16个是对CD中H2S产量与消耗量比例失衡贡献最大的（图4e），而它们不在这种基于组成的分析选择的前30个物种中。
图4与克罗恩病相关的硫化氢生产-消费平衡的转变。a)与健康对照组相比，与CD相关的微生物群中有可能产生或消耗H2S的物种数量显著减少;b）H2S的总估计消耗量在CD中被消耗掉，而产量没有受到显著影响（通量估计为每克干重每小时毫摩尔）。生产者数量与消费者数量之比显著增加；c)估计的H2S总产量与消耗量比例；d)在与CD相关的微生物群中发现；e)参与H2S交换的物种在CD中变化最大，这可能是微生物组治疗的有希望的靶点
讨论在这项工作中，我们引入了一个基于MES的新的概念框架，并将其应用于一个集成的代谢模型数据集，该数据集包含了来自个公开可用的粪便宏基因组的个肠道物种，涵盖了15个国家和11种疾病表型。这种方法揭示了与10种疾病相关的微生物组中潜在的交叉喂养相互作用的显著减少，并在一个病例对照的克罗恩病研究中确定了有前景的治疗靶点。
在这项工作中，我们展示了我们的分析框架可以识别已知和新颖的微生物组-疾病关联，提供了一种成本效益和机制明确的策略来优先考虑实验和指导临床试验。一个例子是类风湿性关节炎和核糖基烟酰胺（也称为烟酰胺核糖或NR）之间的联系。这种代谢物是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的主要前体之一，而NAD+在类风湿性关节炎患者中被报道显著降低。给予NR和其他NAD+前体可以改善类风湿性关节炎患者的临床结果，以及一系列其他的炎症、神经退行性和心血管疾病。据我们所知，这是关于微生物NR代谢在类风湿性关节炎中的作用的首次报道。我们还确定了乙醇是在结直肠癌（CRC）患者中受到交叉喂养丧失影响最大的代谢物。中度到重度的饮酒与发生CRC的风险增加1.17-1.44倍有关，这个过程至少部分是通过微生物组介导的，因为肠道细菌将乙醇代谢为产生致癌的乙醛。仅使用宏基因组数据就能够识别这些和其他一致的代谢物-疾病联系，进一步证明了我们方法的有效性和实用性。我们的研究中观察到的一些关联，如Roseburiaintestinalis和CD之间的联系，可以使用仅基于微生物组组成的分析来检索，但是大多数关联不能（例如，Phocaeicoladorei），而建模框架则提供了关于这些关联背后的代谢和生态过程的额外见解。我们还观察到我们的MES方法和先前基于SMETANA分数的方法之间的互补性。被认为是T2D进展的标志物的代谢物是在健康人群中具有最高MES的代谢物之一，支持了这种代谢物的交换是健康微生物组的一个重要特征的想法。
微生物对交叉喂养的依赖预计会受到肠道环境中代谢物可用性的影响。在健康和疾病中具有显著MES差异的一些代谢物存在于食物中（例如，维生素和糖），突出了饮食在理解肠道微生物组中的交叉喂养的重要性。有趣的是，对于许多代谢物（例如，磷酸盐，葡萄糖，半乳糖和胆碱），我们观察到当物种多样性低时，生产者的比例很高，但随着物种丰富度的增加，消费者的比例超过了生产者（图3）。我们推测，低物种丰富度与缺乏可供消耗的代谢物有关，有利于那些能够自给自足地产生这些代谢物的物种。另一方面，高物种多样性可能与群落的更高的净代谢物产量有关，为消费者物种提供了更多的机会。这一假设与两项最近的研究一致，这些研究表明，与IBD相关的微生物组（通常具有低物种多样性）富含具有完整的必需氨基酸和维生素（包括硫胺素）的合成和代谢途径的细菌的基因组，而健康个体的微生物组则富含预期依赖于交叉喂养来获得必需代谢物的细菌。这些研究，加上我们的结果，表明健康和多样的微生物组对交叉喂养有着广泛的依赖。
我们以CD为一个案例研究，展示了建模框架如何可以帮助定义有机理依据的假设，用于有针对性的实验和临床验证。我们的结果表明，CD患者缺乏能够支持健康H2S平衡的微生物群落成员。这种气体在小量存在时预期对肠道有保护作用，但在大量存在时会破坏粘液层并可能引起炎症。我们的结果支持了最近的一些发现，即IBD患者的微生物组特别缺乏分泌含硫代谢物的能力，并且还表明H2S消费者物种在CD中不成比例地丧失。微生物之间的H2S交换可能通过调节肠腔pH等机制直接影响宿主，或者通过对微生物组组成的级联效应间接影响宿主。
我们在这里应用的建模框架的准确性受到了使用自动化的基因组水平的代谢重建的限制，这些重建代表了接近人工整理的模型的表型，但自然无法预测所有的物种特异性的特征或次级代谢，特别是如果这些依赖于尚未表征的基因和途径。自动化的基因组水平的模型提供了一种自上而下的方法，其中像我们这样的大规模分析可以指导一系列更精细的假设驱动的研究，理想情况下与实验验证相结合。在未来处理较小数据集的研究中，可以通过手动模型整理、整合额外的“组学”数据，例如参考文献47和其他证据线索（例如，基于组成数据训练的机器学习方法），以及通过整合宿主饮食和代谢的个性化数据，来获得更多的精细化。还有一点很重要，只有那些能够重建高质量MAGs的微生物组的原核部分才能被包含在模型中，而且我们的分析是在物种水平（95%ANI）进行的，这可能会忽略代谢方面的菌株水平差异。未来将MES方法与菌株水平的组成信息相结合的研究将对识别健康状况的生物标志物和更好地理解这些复杂的肠道群落的生态学有很高的参考价值。
我们预计，基于宏基因组的代谢模型，再加上对微生物交叉喂养相互作用的评估，将有助于缓解微生物组疗法发展中的一个主要障碍——优先考虑针对哪些物种或代谢产物。通过专注于恢复肠道生态的关键方面，我们可能能够在人类肠道微生物组中引入更有效、更持久的变化。
本文译自：VanessaRMarcelinoetal.Disease-specificlossofmicrobialcross-feedinginteractionsinthehumangut.NatCommun.Oct20;14(1):.